MEDICAL ENTOMOLOGY

مطالبی در مورد حشرات مهم از نظر پزشکی و آفات خانگی

روش های جمع آوری و مطالعات آزمایشگاهی مایت های مهم از نظر پزشکی و دامپزشکی

جمع آوری

در هر جای ممکن باید تعداد زیادی نمونه که شامل اندازه و شکل های مختلف بدن باشند جمع آوری شوند. این کار شانس این که گونه ها، جنس ها و مراحل مختلف چرخه زندگی را در نمونه جمع آوری شده داشته باشیم، افزایش می دهد.

 تجهیزات اولیه

جثه کنه ها و بعضی از مایت ها به اندازه کافی بزرگ هست تا با چشم غیر مسلح دیده شوند، اما توصیه می شود که از یک ذره بین دستی در فیلد و یک میکروسکوپ تشریح (بینوکولار) در آزمایشگاه برای جستجوی گونه های کوچک و مراحل نابالغ استفاده شود.

پنس های سر صاف ساعت سازی برای جمع آوری مراحل نمفی و کنه های بالغ مفید هستند، اما لاروهای کنه و مایت ها به راحتی به کمک یک سوزن یا قلم موی نقاشی که سر آن خیس شده باشد، جمع آوری می شوند. یک سوزن حشره شناسی که ته آن بریده شده و در سر یک چوب کبریت چسبانده شده باشد، ابزار مناسبی برای نمونه های متحرک است و می توان با پهن کردن نوکش آن را به یک کاردک مینیاتوری تبدیل کرد.

مایت هایی که به این ابزار نمی چسبند را می توان با استفاده از یک آسپیراتور (که به صورت عامیانه به آن pooter می گویند) جمع آوری کرد. این یک روش به ویژه موثر برای صید مایت هایی است که به سرعت حرکت می کنند بدون اینکه به آنها آسیبی برسد. آسپیراتور اصلی متشکل از یک ویال شیشه ای به عنوان لوله جمع آورنده است (یک فلاسک یا بطری می تواند جانشین آن شود)، که با یک مجرای پلاستیکی که یک لوله شیشه ای بلند و کوتاه دارد محصور می شود. طول لوله پلاستیکی یا پلی اتیلنی متصل به انتهای برآمده هر یک از دو لوله شیشه ای متصل است،لوله روی لوله بلندتر یک راه ورود را تشکیل می دهد، و لوله کوچکتر وارد دهان شده و از طریق آن هوا مکیده می شود. کنترل بیشتری را می توان از طریق ثابت کردن یک لوله شیشه ای به لوله ورودی بدست آورد، ضمن این که جلوی ورود اشیای خارجی را می توان با وارد کردن یک توری در انتهای لوله جمع آوری گرفت. همچنین مکش هوا را می توان به وسیله یک حباب پلاستیکی دستی که به لوله دهانی متصل می شود انجام داد. مزیت این کار جلوگیری از ورود مواد مضر یا نامطلوب به دهان فرد جمع آوری کننده می باشد. نمونه ها را می توان به طور مستقیم به داخل مواد نگهدارنده مانند اتانول 70%، با افزودن یک ویال شیشه ای به انتهای لوله جمع آوری انجام داد.

سینی های پلاستیکی سفید یا لعابی برای کار فیلد مفید هستند، مایت ها و کنه ها در روی زمینه سفید به خوبی دیده می شوند، موقعی که به روی زمین می افتند، سینی ها می توانند به عنوان یک طعمه برای لارو مایت های ترومبیسیده عمل کنند (به قسمت استخراج نمونه ها از زیستگاههای مرتبط با میزبان مراجعه شود). درپوش ویالهای شیشه ای باید برای ذخیره فوری نمونه ها در دسترس باشد (به نگهدارنده ها مراجعه شود).

کیسه های پلاستیکی با ضخامت متوسط یا زیاد که با یک نوار کشی قابل ارتجاع بسته می شوند، برای انتقال حیوانات مرده کوچک یا نمونه هایی از زیستگاههای حیوانات به آزمایشگاه مناسب هستند. موقعی که مایت ها یا کنه ها هنوز زنده هستند، باید مطمئن شویم که ظروف نمونه عاری از آلودگی های چند گانه باشند و باید برای نمونه های تخلیه شده موقعی که میزبان از آن برای بررسی خارج شده کنترل شوند.

 اتیکت زدن

 هر نمونه ای که جمع آوری می شود باید اتیکت مشخصات برای آن تهیه گردد. اطلاعات موجود در اتیکت شامل محل جمع آوری، زیستگاه، تاریخ جمع آوری، نام جمع آوری کننده و در مورد انگل، نام و شرایط میزبان، محل آن روی بدن و میزان آلودگی نیز باید درج گردد. جزئیات باید با یک مداد نرم (2B) یا توسط جوهر مقاوم در برابر الکل و آب ثبت شوند. برچسب های بسته بندی tie-on برای نمونه هایی که درون کیسه های پلاستیکی قرار داده می شوند مناسب هستند، اما موقعی که نمونه جمع آوری شده مستقیما به درون محلول نگهدارنده منتقل می شود، برچسب (کاغذ ضخیم، مثل کاغذ پوست بز) اغلب درون ظرف سالم می ماند.

 جمع آوری نمونه هایی که در بافت های میزبان فرو نرفته اند

آزمایش مستقیم. مایت ها و کنه ها را می توان در تمام قسمتهای بدن میزبانشان یافت، اما بعضی گونه ها مناطق خاصی را ترجیح می دهند. بر روی پستانداران، گوش ها، پوزه، چانه، قسمت وسطی زیر شکم و نواحی زیر بغل و کشاله ران باید بررسی شوند و بر روی پرندگان قسمتهای فلس دار پاها و صورت، داخل ساقه توخالی پرها و بین موهای کوچک پرها دیده می شوند. مایت های انگل داخلی اغلب درون ماهیچه ها و در دستگاههای گوارش و تنفس دیده می شوند، اما به ندرت در داخل یا روی سایر اعضا ممکن است یافت شوند.

شانه و برس زدن. نمونه هایی که از محل خود بیرون رانده می شوند را در هنگامی که شانه یا برس زدن بدن میزبان روی سینی یا ورقه سفید انجام می شود، راحت تر می توان مشاهده نمود. در صورتی که میزبان مرده باشد، می توان با قرار دادن لاشه میزبان درون یک جعبه محتوی یک لایه پنبه آغشته به اتر برای مدت 30 دقیقه، مایت ها و کنه هایی را که هنوز زنده اند و بدن میزبان خود را ترک می کنند بیهوش کرده و صید نمود.

شناورسازی. نمونه ها را می توان از میزبان های زنده با تکان دادن بدن میزبان در یک تشتک یا کیسه پلاستیکی که محتوی یک محلول رقیق مواد شوینده است (مایع شستشو مناسب است) و سپس صاف کردن این مایع با کاغذ صافی جدا نمود. کنه ها و مایت ها دارای یک کوتیکول آب گریز هستند و ماده شوینده با کاهش کشش سطحی آب به آزاد شدن آنها از سطح بدن میزبان کمک می کند. روش شناورسازی ساده زیر برای استحصال انگل های خارجی از میزبان های مهره دار درست شده است.

1) بدن یا پوست را داخل یک کیسه قرار داده و برای حداقل یک روز داخل یخچال قرار دهید تا انگل های خارجی کشته شوند.

2)  پس از این مدت نمونه را بیرون آورده و اجازه دهید تا به دمای اتاق برسد

3)   بدن را برای حداقل مدت 30 دقیقه درون یک جار محتوی ماده شوینده، مثل مایع شستشو، به عنوان یک ماده خیس کننده تکان دهید.

4)  میزبان را بیرون آورده، محلول را درون یک جار بلند بریزید و برای حداقل 15 دقیقه صبر کنید تا رسوب محتوی انگل های خارجی ته نشین کند.

5) به دقت و آرام مایع بالای رسوب را خالی کنید بدون این که رسوب بدست آمده تکان بخورد.

6) مایع باقی مانده و رسوب را به درون یک بشقاب کم عمق ریخته و زیر میکروسکوپ تشریح (بینوکولار) ملاحظه نمایید. به جای این کار می توانید مایع را از کاغذ صافی یا الک با قطر روزنه 100 میکرومتر عبور دهید تا باقی مانده آن را بدست آورید.

یک روش تغییر یافته این روش که تکان دادن مکانیکی و روش های صاف کردن را تلفیق می کند به میزان قابل ملاحظه ای کارآیی کشف نمونه را بهبود بخشید.

  روش های قیف-خشک کردن. این ها ما را قادر می سازند تا نمونه های زنده فعال را از میزبان های مرده کوچک با استفاده از پاسخ منفی مایت ها و کنه ها به خشکی جدا کنیم. بدن میزبان روی یک صفحه مشبک قرار داده می شود (روزنه 3 میلی متر) که در قسمت دهانه گشاد یک قیف قرار می گیرد یا دقیقا در زیر لبه آن فیکس می شود. همانطور که خشکی پیشرفت می کند، مایت ها و کنه ها قادر به جاسازی در بافت میزبان نبوده و به سمت پایین حرکت می کنند تا زمانی که از توری و قیف به پایین می افتند و سرانجام به درون ظرف مایع نگهدارنده، مثل اتانول 70%، که زیر قسمت خروجی قیف قرار گرفته سقوط می کنند. یک لامپ برق (75 وات یا کمتر) که مستقیما بالای نمونه قرار داده می شود سرعت خشک شدن را افزایش می دهد، اما حرارت نباید خیلی تند باشد زیرا نمونه ها ممکن است قبل از اینکه بتوانند از بدن میزبان جدا شوند، بمیرند. وسیله اصلی برای این روش به طرق مختلفی ساخته شده است.

  موقعی که خز یا پر میزبان خشک شده باشد (حداقل پس از 4 ساعت)، محتویات لوله جمع آوری را می توان درون پتری دیش خالی کرد یا قبل از بررسی از کاغذ صافی عبور داد. نمونه های زنده را می توان به جای استفاده از مایع نگهدارنده، با گذاشتن یک حوله کاغذی مرطوب روی کف لوله جمع آوری بدست آورد.

 بیرون کشیدن نمونه هایی که در بافت های میزبان فرو رفته اند

موقعی که کنه های چسبیده به میزبانشان را بیرون می کشید، این نکته حائز اهمیت زیادی است که قطعات دهانی کنه در بدن میزبان باقی نماند. این امر هم از نظر جلوگیری از ایجاد عفونت ثانویه در میزبان و هم از نظر ارزش قطعات دهانی باقیمانده در بدن میزبان از نظر شناسایی گونه کنه اهمیت می باشد. کنه را باید به کمک پنس یا بین شست و انگشت نشانه در نزدیکترین حد ممکن به بدن میزبان گرفت و با یک حرکت محکم و سریع بیرون کشید. شل کردن کنه های زنده با خیس کردن محل اتصال کنه به بدن میزبان به کمک گلیسرول یا الکل می تواند عمل خارج کردن آنها را آسان تر سازد.

معمولا مایت ها به صورت فرو رفته در بافت میزبانشان یافت می شوند که ممکن است در طی عمل شانه زدن یا شناورسازی از جای خود بیرون آورده شوند. با وجود این، روش های دیگری برای جدا کردن نمونه هایی که یا محکم به میزبان چسبیده اند و یا واقعا در پوست مدفون شده اند لازم هستند. یک روش ساده مونته کردن نمونه های بافت در یک قطره هیدروکسید پتاسیم یا هیدروکسید سدیم  10% روی لام های میکروسکوپی مسطح و گذاشتن یک لامل بر روی آن و شفاف کردن نمونه با گرمادهی به مدت 5 تا10 دقیقه می باشد. فشار آرام بر روی لامل پس از گرمادهی به جدا شدن نمونه از بافت له شده کمک می کند. تغییرات شامل هضم اولیه بافت در تریپسین و افزودن یک درصد توین 80 (پلی اتیلن سوربیتان مونواولئات) به 10 درصد محلول هیدروکسید پتاسیم می باشد.

یک روش ساده دیگر مونته و گرم کردن تراشیده های پوست میزبان در محلول زیر است:

اسید لاکتیک 60 درصد                                   60 قسمت

گلیسرین                                                     40 قسمت

لیگنین پینک                                                  2-1 قطره

 لیگنین پینک کیتین را رنگ آمیزی می کند و بنابراین هر مایت موجود در درجات مختلفی از رنگ صورتی دیده می شود.

 بدست آوردن نمونه ها از زیستگاههای مرتبط با میزبان

مراحل فعال را می توان از جای خواب، لانه ها، غذا و برخی از مواد دفعی حیوانات با استفاده از روش قیف-خشک کردن که در بالا توصیف شد استخراج نمود. اگر نمونه جمع آوری شده از این مناطق دارای مواد نرم و سستی باشد، با گذاشتن یک لایه پرده توری درشت بافت بر روی غربال می توان آلودگی ماده نگهدارنده در اثر ریزش این مواد به درون آن را کاهش داد، اما هنوز نمونه های مایت می توانند از لابلای آن عبور کنند. نمونه های بدست آمده از زیستگاهها بسته به اندازه و ترکیباتشان باید برای یک دوره چهار روزه تا دو هفته ای نگهداری شوند تا اطمینان حاصل گردد که کاملا خشک شده اند و ساکنینش زمان برای خروج از آن را داشته اند. یک تطبیقی از روش قیف-خشک کردن که مایت و کنه هایی را که با حرکت به سمت بالا یا پایین از نمونه خارج شده اند را جمع آوری می نماید، برای استخراج مراحل لاروی کنه ها از خاک و آشغال ها توصیه شده است.

مایت ها و کنه ها را همچنین می توان از مواد خشک نرم از طریق تکاندن نمونه ها از طریق یک سری الک سیمی که به ترتیب توری آنها ریز تر می شود، بدست آورد. الک رویی با اندازه روزنه تقریبا 1 میلی متر تعداد زیادی از آشغال ها را می گیرد، ضمن این که الک زیری با قطر روزنه 80 میکرومتر نمونه ها را صید خواهد کرد. یک فواره آب یا الکل که مستقیما به پشت الک زیری می ریزد را می توان برای شستشوی نمونه ها درون یک ظرف برای بررسی استفاده نمود.

مایت های گرد و غبار فعال را می توان مستقیما از رختخواب، قالی ها و .... به کمک نوار چسب صید کرد. گرم کردن پشت پارچه ای که نوار به آن می چسبد، سطح رطوبت را کاهش می دهد و مایت ها را به سمت نوار چسب هدایت می کند. همچنین می توان یک بطری آب گرم (محتوی آب حدود 40 درجه سانتی گراد) را در پشت نوار قرار داد، روی آن را پوشاند و برای مدت 12 ساعت آن را به همین صورت گذاشت. زیرا دما به اندازه کافی بالا نیست که رطوبت را کاهش دهد، اما کافی است که فعالیت آنها را افزایش دهد، مایت ها به سمت منبع گرما حرکت خواهند کرد و به نوار خواهند چسبید. می توان نمونه های مایت زنده یا مرده را به کمک جاروبرقی یا برس از رختخواب جدا کرد. نمونه هایی که توسط جاروبرقی جمع شده اند را می توان هم از درون کیسه جاور جمع آوری نمود، مثلا یک دستمال بر روی دهانه جارو قرار دهید. هر نمونه موجود را می توان با بررسی مستقیم یا روش های تهیه سوسپانسیون یا شناورسازی کشف نمود. یک استخراج سوسپانسیون ساده شامل پخش کردن ذران غبار در ظرف شیشه ای کم عمق، پوشاندن 60-50 درصد اسید لاکتیک حاوی چند قطره از لیگنین صورتی، و گرمادهی در 70-60 درجه سانتیگراد به مدت حدود 30 دقیقه برای شفاف کردن و رنگ آمیزی مایت هاست. روش های شناورسازی از تفاوت در چگالی بین دو مایع  برای تفکیک نمونه ها استفاده می کنند، به عنوان مثال خیساندن نمونه های گرد و غبار در اتانول 80 درصد برای حداقل چهار ساعت، افزودن محلول کلرید سدیم اشباع (نمک) و مخلوط کردن آنها منجر به شناورسازی مایت ها در سطح می شود.

اگر چیگرها (مراحل لاروی مایت های ترومبیکولیده) در یک محل وجو داشتند، آنها در طی حدود 15 دقیقه روی تقریبا هر شیئی خارجی که روی زمین می افتند تجمع می کنند. یک تله اساسی شامل 5/0 متر مربع از ماده ضد نور با یک پنجره 5 سانتیمتری در مرکزی از سلوفان است. این تله بر روی ناحیه مورد بررسی گذاشته می شود و لبه های آن به سمت پایین سنگین می شوند. چون چیگرها پاسخ مثبت به نور دارند، آنها به سمت پنجره حرکت خواهند کرد و بر روی سطح زیری آن جمع خواهند شد.

دی اکسیدکربن را می توان برای جذب کنه هایی که در جستجوی میزبان هستند با قرار دادن بلوک 1 کیلوگرمی یخ خشک در یک ظرف سوراخ دار بر روی یک ورقه سفید مورد استفاده قرارداد، اگرچه باید به خاطر داشت که این روش برای همه گونه ها موثر نیست. تغییرات شامل قرار دادن یک مانع چسبنده در اطراف تله برای تعیین اینکه از کدام جهت کنه ها می آیند، و استفاده از پودر کربنات کلسیم (CaCO3) و اسید لاکتیک رقیق برای تولید دی اکسید کربن است. تله دی اکسید کربن هم برای کنه های سخت خانواده Ixodidae و هم برای کنه های نرم خانواده Argasidae موثر است.

کنه ها بر روی رویش گیاهی در مراتع را می توان با کشیدن یک پتو یا پارچه پشمی (به ابعاد حدود 5/1 در 1 متر) که از یک طرف به یک قطعه چوب متصل شده و این چوب از دو گوشه به طناب وصل گردیده، بر روی زمین جمع آوری نمود . با قرار دادن این قطعه چوب بر روی زمین فرد جمع آورنده یه آرامی پارچه را بر روی زمین می کشد. کنه هایی که به این پارچه چسبیده اند، آن را با یک میزبان که از محل عبور می کرده اشتباه گرفته اند. این کنه ها را به طور منظم می توان توسط پنس یا انگشت جمع آوری نمود. برخی محققین یک زنجیر یا خط از واشرهای فلزی سنگین را در طول لبه انتهایی پارچه می دوزند تا بیشترین تماس با زمین را داشته باشد. حرکت دادن پرچم مشابه کشیدن پارچه است اما از یک طرف به طرف دیگر در جلوی فرد جمع آورنده حرکت داده می شود و برای جمع آوری از رویش گیاهی بلندتر مناسب تر است. در ساده ترین فرم آن، پرچم یک تکه پتوی مربعی تغییر نیافته است که از یک گوشه کشیده می شود. چسباندن یک batten که کمی بلندتر از لبه پتو است یک دسته برای فرد کاربر فراهم می کند، ضمن این که استفاده از تعدادی نوار موازی پارچه با یک زنجیر متصل به هر لبه آزاد آن کارآیی آن را افزایش می دهد . یک پرچم که بر روی یک دسته بلند نصب شده است این مزیت را دارد که به استفاده کننده اجازه می دهد که در موقعی حرکت دادن پرچم بر روی رویش گیاهی و زیر شاخه های افتاده خم نشود.

 کنسرو کردن نمونه

 مواد نگهدارنده

مایت ها و کنه ها را می توان به صورت دائمی و سالم درون اتانول یا متالدهید صنعتی (۹۵ درصد اتانول، 5 درصد متانول) که به کمک آب مقطر تا 80-70 درصد رقیق شده باشد نگهداری نمود. قرار دادن نمونه برای چندین سال در الکل می تواند بافت های آن را سفت کند، نمونه را برای مونته کردن نامناسب سازد، و برخی محققین توصیه می کنند که 5 درصد گلیسیرین برای جلوگیری از این مشکل به محلول نگهدارنده اضافه شود. افزودن گلیسیرین همچنین جلوی خشک شدن کامل را به دلیل تبخیر الکل می گیرد، اما یک لایه تیره در روی نمونه بر جای می گذارد و این می تواند بر مطالعه میکروسکوپی نمونه تاثیر گذار باشد. مابع اودمن، نگهدارنده دیگری که برای نگهداری طولانی مدت کنه ها و مایت ها مورد استفاده است، گلیسیرین را به شرح زیر ترکیب کرده است:

گلیسیرین                                                              5 قسمت

الکل 70 درصد                                                        87 قسمت

اسید استیک گلاسیال                                              8 قسمت

 

مایع کوئنیک یک جایگزین برای نگهدارنده های الکلی است و از این نظر که قابلیت انعطاف بافت ها را حفظ می کند مورد توجه است. آن شامل موارد زیر است:

اسید استیک گلاسیال                                                 10 قسمت

گلیسیرین                                                                  50 قسمت

آب مقطر                                                                    50 قسمت

 

ظروف نگهداری

کنه های بزرگ را می توان در ویال های شیشه ای با اندازه مناسب که به اندازه کافی برای نصب برچسب مشخصات جا داشته باشند نگهداری نمود. قابل توصیه است که مراحل لاروی کنه ها را درون ویال های کوچک (تقریبا 25x6 میلیمتر) درون یک لوله بزرگ تر (تقریبا 62x12 میلی متر) گذاشته شوند. این ترتیب قرار دادن نمونه های کوچک را ساده تر می سازد و همچنین خطر آسیب ناشی از تبخیر ماده نگهدارنده را به حداقل می رساند.

در ویال ها را می توان با درپوش های پلی اتیلنی یا درپوش های با نام تجاری Plastazote به خوبی بست. از چوب پنبه نباید استفاده شود زیرا هوا از آنها عبور می کند و الکل از درون آن تراوش می نماید، نمونه ها را رنگ کرده و لذا به اندازه کافی برای مطالعه میکروسکوپی شفاف نخواهند بود. درپوشهای پنبه ای مناسب نیستند زیرا نمونه ها ممکن است درون الیاف آن گیر بیفتند، آسیب ببینند یا از بین بروند. در شرایط اضطراری می توان از یک دستمال کاغذی که محکم مچاله شده باشد به جای درپوش استفاده نمود.

نمونه ها در حالت عمودی درون جارهای غیر قابل نفوذ به هوا که محتوی مقدار کافی الکل برای پوشاندن کامل ویال ها است نگهداری می شوند. ظروف شیشه ای با درپوش چوب پنبه یا پلاستیک یا درپیچ را می توان استفاده کرد اما نیاز به کنترل فراوان برای درپوش ها درز دار یا پوسیدگی دارد تا از عدم ورود هوا به درون آن اطمینان حاصل شود.

 نصب برچسب مشخصات

هر لوله باید محتوی یک برچسب مشخصات باشد که اطلاعات جمع آوری را ارائه دهد (به جمع آوری: برچسب مشخصات زدن مراجعه شود) و تشخیص نمونه ها و نام فردی که شناسایی را انجام داده است را هم شامل شود. موقعی که از سیستم دو لوله درون هم استفاده می شود، برچسب مشخصات بر روی لوله بیرونی نصب می شود. یک برچسب در داخل جار گذاشته می شود که محتوی نمونه ها و توصیف محتویات آنهاست. کاغذ پوست بز یا کاغذ با کیفیت برای مدت طولانی در الکل باقی می ماند، ضمن این که جوهر هندی یا به طور موقتی، مداد نرم (2B) در برابر آب و الکل مقاومند.

 آماده سازی برای بررسی میکروسکوپی

 مایت ها و مراحل لاروی کنه ها

مایت ها و مراحل لاروی کنه ها به خاطر جثه کوچکی که دارند باید با درشتنمایی بالای میکروسکوپ نوری بررسی شوند (اغلب 200 تا 100 برابر). هر دو نوع phase-contrast و differential interference contract کار با میکروسکوپ اجازه می دهد که مشخصات نمونه بسیار ساده تر ملاحظه شوند. تشخیص نمونه ها اصولا بر مبنای ویژگیهای اسکلت خارجی است و بنابراین، قبل از آزمایش، لازم است کوتیکول شفاف شود و بافت داخلی خارج شود تا اجازه عبور به نور میکروسکوپ از داخل بدن را بدهد. عوامل شفاف کننده موثر  اسید لاکتیک (60-50 درصد حجم/حجم آب مقطر) و لاکتوفنل (اسید لاکتیک 50 قسمت، کریستال های فنل 25 قسمت، آب مقطر 25 قسمت) هستند که هر دوی این مواد به عنوان مونته کننده های موقتی به کار می روند. فرایند مونته منجر به پهن شدن بدن نمونه می شود. گاهی اوقات در نمونه مونته شده سطوح پشتی و شکمی بدن آنچنان نزدیک به هم می شوند که وقتی زیر میکروسکوپ نمونه را می بینید دو سطح به نظر می رسد که روی هم قرار داده شده اند. در موقع جستجو برای ویژگیهای تشخیصی، بنابراین مهم است بدانیم کدام سطح را ملاحظه می کنیم.

 مونته های موقت. مزیت این ها این است که به نمونه ها اجازه می دهند در طول بررسی شفاف و درخشان بماند. آنها همچنین در صورتی که نیاز به مونته دائمی نباشد این امکان را بما می دهند که نمونه داخل آنها را مستقیما به الکل برگرداند. مونته های موقتی به شرح زیر ساخته می شوند:

1)    یک قطره اسید لاکتیک یا لاکتوفنل 60-50 درصد را در مرکز یک لام تخت یا برای نمونه های بزرگتر در لام گود (لام با ضخامت 8/0 تا 1 میلی متر توصیه می شود) بگذارید.

2)       نمونه/ها را در وسط قطره گذاشته و آن را به پایین به سمت سطح لام فشار دهید.

3)       یک لامل (قطر19 میلی متر، ضخامت شماره صفر) را در لبه مایع مونته قرار داده و به آرامی بر روی نمونه/ها بگذارید.

4)    لام را بر روی یک صفحه گرم یا صفحه گرم کن عکاسی در 70-60 درجه سانتیگراد گرما دهید تا محتویات بدن حل شوند. مایت ها که بدن ظریفی دارند باید در حدود 20 دقیقه گرما داده شوند (آنها همچنین اگر در طول شب در دمای اتاق هم قرار داده شوند شفاف خواهند شد)، ضمن این که نمونه هایی که بدن ستبر تری دارند مستلزم گرما دهی به مدت 45 دقیقه یا بیشتر هستند.

5)       نمونه ها را همانطور که توصیه شد با فشار دادن آرام لبه لامل قرار دهید.

 

محتویات دستگاه گوارش نمونه هایی که خونخورده اند اغلب کار تشخیص را با مشکل مواجه می کند. سوراخ کردن بدن این نمونه ها قبل از قرار دادن لامل میزان شفافیت را بهبود بخشیده و حداقل قادر می سازد که مقداری از خون به آرامی از بدن بیرون رود. چنین نمونه هایی ممکن است نیاز باشد که در یک ماده شفاف کننده قوی تر از اسید لاکتیک قرار داده شوند. محلول آبی 10 درصد هیدروکسید سدیم یا پتاسیم معمولا موثر تر است.

            قسمت های مختلف بدن را می توان با افزودن یک قطره از رنگ انتخابی کیتین از قبیل لیگنین صورتی، (به استخراج نمونه هایی که در بافت های میزبان فرو رفته اند مراجعه شود) یا کرزول سیاه به مایع مونته شفاف تر نمود.

            اگرچه مونته های موقتی برای استفاده کوتاه مدت مطلوب هستند، این امکان وجود دارد که آنها را با خارج کردن اسید لاکتیک اضافی از اطراف لامل و درزگیری آن به عنوان مثال با اوپارال یا گلیسیل یا لاک ناخن برای چندین ماه نگهداری نمود.

 

مونته های دائمی. این ها نمونه ها را در شرایط خوب در طول دوره های طولانی نگهداری می کنند و موقعی که نمونه ها برای نگهداری در کلکسیون های مرجع لازم هستند توصیه می شوند. پایه مواد مونته کننده به طور گسترده برای مایت ها و مراحل لاروی کنه ها استفاده می شوند، صمغ کلرال است، اگرچه برخی محققین موادی را که بر پایه پلی وینیل الکل (PVA) یا رزین هستند، ترجیح می دهند.

 مایع بِرلِز یک مونته کننده تجاری موجود بر پایه صمغ کلرال است که به طور سنتی برای کنه ها و مایت ها به کار می رود. یک مایع مونته دیگر که استفاده فراوان و مختلفی دارد، محیط هویِر است که محلول آماده مصرف آن در بازار وجود ندارد، اما می توان آن را با مخلوط کردن مواد زیر در دمای اتاق ساخت. این محلول وقتی آماده مصرف است که ترکیبات جامد آن ناپدید شود.

آب مقطر                                                      50 قسمت

صمغ عربی کریستاله                                      30 قسمت

کلرال هیدرات                                                 200 قسمت

گلیسرین                                                       20 قسمت

 

محلول حاصل باید از کاغذ صافی یا پارچه ابریشمی عبور داده شود تا ناخالصی های آن گرفته شود و سپس در ظرف غیر قابل نفوذ به هوا نگهداری گردد.

مقدار کلرال هیدرات در هر دو محلول مایع برلز و محیط هویر برای شفاف کردن نمونه هایی که به مقدار کمی اسکلروتیزه شده اند، کافی است، اما مراحل لاروی کنه ها و اکثر مایت ها باید قبل از تهیه مونته دائمی شفاف شوند (به مونته های موقت مراجعه کنید). نمونه هایی که از اسید لاکتیک به لاکتوفنل منتقل می شوند ابتدا باید کاملا در الکل 70 درصد شسته شوند تا از کریستالیزه شدن محلول مونته جلوگیری بعمل آید.

به طور ایده ال، نمونه ها طوری مونته می شوند که بدن آنها موازی کناره های کوتاه لام باشد به طوری که بتوان آنها را با انتهای جلویی بدن که دور از مشاهده کننده قرار می گیرد، ملاحظه نمود. اگر نمونه ها در این وضعیت مونته شوند مشاهده ویژگی های تشخیصی آنها راحت تر خواهد بود. مراحل لاروی کنه ها اغلب طوری مونته می شوند که سطح پشتی آنها رو به بالا باشد. اگر یک نمونه حاوی تعدادی مایت متعلق به یک گونه باشد، با ارزش است که تعدادی از آنها را در سطح پشتی و تعدادی را در سطح شکمی مونته کنید به طوری که ساختارهای مختلف موجود بر روی هر دو سطح بدن را بتوان به وضوح دید. نمونه ها را می توان در مایع مونته با کمک یک جفت سوزن مونته تشریح نمود.

دستورالعمل مونته کردن مشابه تهیه مونته موقتی است با این تفاوت که لامل های با قطر کمتر (13 میلی متر) معمولا در این روش استفاده می شوند. تنظمیات وضعیت قرار گرفتن نمونه با حرکت آرام لامل انجام می شود و لام سپس به مدت 15-10 دقیقه روی یک hot-plate در حدود 45 درجه سانتی گراد حرارت داده می شود. در طی این مدت، نمونه باید چک شود تا اطمینان حاصل گردد در وضعیت مورد نیاز قرار گرفته باشد و در صورت نیاز جهت آن عوض شود. این گرم کردن اولیه باعث می شود مایع مونته منبسط شود که به نوبه خود منجر به کشیده شدن ضمائم بدن مایت/کنه می شود. خشک شدن در یک آون 40 درجه سانتیگراد در طی مدت 14-10 روز کامل می شود.

چون محلولهای مونته بر پایه کلرال هیدرات به رطوبت وابسته اند، به تدریج رطوبت را از هوا بدست خواهند آورد، مگر اینکه پس از خشک شدن درزهای اطراف لامل آنها گرفته شود. این کار را می توان با کشیدن دو سه لایه گلیپتال یا گلیسیل انجام داد، البته باید پس از خشک شدن هر لایه، لایه بعدی را کشید. لاک ناخن نیز به این منظور می تواند مورد استفاده قرار گیرد اما مستعد پوسته پوسته شدن است. یک صفحه مدور مخصوص حلقه دور لامل کار درزگیری لامل ها را تسریع می کند، به ویژه هنگامی که تعداد لام ها زیاد باشد.

در صورتی که مونته مجدد لازم باشد، نمونه ها را می توان با داغ کردن حلقه درزگیری شده به کمک یک سرسوزن یا اسکالپِل و خیساندن لامل در آب گرم دوباره بدست آورد (محیط های مونته صمغ کلرال) یا گلیسرین (محیط های مونته پلی وینیل الکل). حداقل عمق ممکن از مایع مونته را که برای پوشاندن لام لازم است استفاده کنید و جریان حرکت آن را چک نمایید، به طوری که نمونه شناور نباشد.

 همانند نمونه های spirit-stored ، تهیه اسلاید باید جزئیات کامل ماده کنسرو شده را پوشش دهد. برچسب های مشخصات طوری تنظیم شده اند که موقعی که لام زیر میکروسکوپ است، بتوان آنها را به آسانی خواند، به عبارت دیگر اطلاعات موازی با ضلع بلند لام نوشته می شوند.

یک برچسب (برچسب یا کاغذی که توسط چسب روی لام چسبانده می شود) در هر یک از دو انتهای لام نصب می شو.د برچسب سمت چپ حاوی نام جنس و گونه، جنس و مرحله زندگی نمونه/ها، نام فرد شناسایی کننده، تاریخ شناسایی و نوع ماده مونته مصرفی است. این مورد آخری برای این است که اگر نمونه نیاز به مونته مجدد داشته باشد، بتوان از روش مناسب برای این کار استفاده نمود. برچسب سمت راست محتوی اطلاعات در مورد جمع آوری شامل محل صید، میزبان/زیستگاه، جمع آوری کننده و تاریخ صید است.

 مراحل نمفی و بالغ کنه ها

مراحل نمفی و بالغ کنه ها به علت اندازه بزرگشان مستقیما در زیر میکروسکوپ تشریح (بینوکولار) مشاهده شده و مونته نمی شوند. برای دیدن ویژگی های تشخیصی باید بتوان نمونه را از همه زوایا دید. یک وسیله ساده و ارزان برای انجام این کار گوی و collar است که از غلتک یک بطری اسپری خوشبوکننده بدست می آید. کنه بر روی فرورفتگی در یک قطعه کوچک Blu-tack یا plasticine پرس شده بر روی نوک گوی قرار می گیرد و می توان آن را در وضعیت دلخواه قرار داد. لایه تار مایع قرار گرفته بر روی نمونه مستقیما از مایع نگهدارنده بدست می آید را می توان به سرعت با گذاشتن نمونه روی کاغذ خشک کن برای چند ثانیه بر طرف کرد.

  برگرفته از کتاب مایت ها و کنه های حیوانات اهلی نوشته خانم دکتر آن اس. بیکر - گروه حشره شناسی موزه تاریخ طبیعی لندن

+ نوشته شده در  88/04/21ساعت   توسط احمدعلی حنفی بجد  |